TRIM21是一种已知的胞质Fc受体，在抗体介导的细胞内免疫中起着重要作用。之前的研究表明TRIM21与抗体的Fc区域结合，能够中和已经进入细胞的病毒，并通过泛素-蛋白酶体系统将其靶向降解，但是具体的工作机制还不是非常清楚。

    Roche研发人员最近的工作发现了TRIM21识别、结合并促进抗体包被病毒的蛋白酶体降解的能力，在很大程度上依赖于其与抗体Fc区域相互作用的亲和力(Affinity)和功能亲合力(Aidity)。 经过一些列测试后研究人员提出了一种新的结合机制，TRIM21与一个Fc位点的结合导致PRYSPRY从螺旋卷曲域上脱落，由于其柔性连接链增加了流动性，从而促进了Fc第二个位点的结合，这种双价结合产生了功能亲合力(Aidity)。

    为了研究TRIM21与IgG的结合动态，研究人员首先采用两种重组TRIM21构建体，同时构建了包含PRYSPRY和卷曲螺旋结构域的TRIM21-CC-PS的结构，来模拟TRIM21的天然二聚体状态。然后通过SPR的方法测试TRIM21与一系列human IgG1 (mAb1)突变体的亲和力。

Interaction analysis of human IgG1 (mAb1) Fc variants and TRIM21 PRYSPRY domain

    实验结果展示了抗体Fc端具有双价态结合功能可以与两个TRIM21结合，利用单分子质量光度系统不但可以确认SPR的测试结果，而且由于TRIM21天然形成同源二聚体具有比传统1:1相互作用更为复杂的结合模式，质量光度系统具有更大的优势来测定结合化学计量比。

    大多数抗体构建体对PRYSPRY的亲和力是相似的，但是结合界面的关键残基上含有Fc突变的变体YTE（M252Y, S254T, T256E）、HH（T307H, N434H）和Y436A，对PRYSPRY结构域的亲和力比野生型（WT）更低一些，结合强度顺序如下：WT具有最强的亲和力，其次是YTE，然后是HH，Y436A的亲和力最弱。研究人员还发现Y436A与野生型相比亲和力降低了180倍，SPR和单分子质量光度系统（MP）结果揭示了PRYSPRY-IgG的化学计量比为2:1，且没有表现出任何结合协同性，没有显示Fab结合的额外贡献。

Mass distribution of Fc WT / cytokine-Fc Fusion WT / cytokine-Fc Fusion WT-AAA

Mass distribution of cytokine-Fc Fusion WT / WT-AAA / Y436A

    研究人员随后进一步确定了TRIM21-CC-PS二聚体的状态，二聚体结构的预期理论分子量是86千道尔顿。体积排阻色谱-多角光散射（SEC-MALS）显示，94%的颗粒质量约为90千道尔顿。质量光度测量（MP）显示99%的颗粒重量为82 ± 13千道尔顿。电子显微镜分析揭示，PRYSPRY结构域彼此相对，卷曲螺旋结构域在中间介导其二聚体化。

Dimer of TRIM21-CC-PS determined by MP and EM

    为了深入研究TRIM21-CC-PS与抗体Fc的结合模式，研究人员进一步采用了单分子质量光度系统和EM两种技术。在MP测量中，将不同浓度递增的TRIM21-CC-PS与三种抗体Fc变体（mAb1 WT、mAb1 WT-AAA和mAb1 AAA）分别以不同的摩尔比例孵化。将TRIM21-CC-PS与mAb1混合后，出现了大约80 kDa和140 kDa的峰，分别代表未结合的TRIM21-CC-PS和mAb1。在大约230 kDa处出现了第三个峰，其分子量对应于由一个TRIM21-CC-PS和一个mAb1 WT组成的复合物。随着TRIM21-CC-PS浓度的增加，平衡向结合物种转移直到几乎所有的抗体都被结合。在TRIM21-CC-PS的10倍摩尔过量下，24%的TRIM21-CC-PS和mAb1 WT结合，揭示了1:1的化学计量比，其中一个二聚体同时与两个IgG重链结合。在低纳摩尔浓度下检测TRIM21-CC-PS与mAb1 WT的相互作用，也使研究人员洞察到了二聚体结合导致的强烈相互作用，进而实现功能亲合力(Avidity)结合模式。

    另外，mAb1 WT-AAA浓度显示了很小一部分结合分数（约2%），而AAA变体则没有形成复合物。有意思的是研究人员预期mAb1 WT-AAA变体会有结合，但是实验中只观察到两个Fc重链中的一个结合导致了亲和力变弱，而对称的AAA突变完全取消了TRIM21的结合。值得注意的是，数据表明TRIM21可以通过与一个结合位点与A20抗体的两个不同Fc区域的同时相互作用，从而最终诱导AAV颗粒聚集。

Investigate the TRIM21-CC-PS - Antibody Fc binding mode by MP

    在低纳摩尔浓度下检测到TRIM21-CC-PS与mAb1野生型之间的相互作用，正如在AlphaFold模型（Uniprot ID P19474）中所观察到的，PRYSPRY结构域通过一个柔性连接链附着在其螺旋上。这个连接链可能通过将PRYSPRY结构域彼此拉近，允许二聚体结合。

     最后，研究人员探索了TRIM21与重组腺相关病毒载体(rAAVv)颗粒之间的相互作用，发现通过TRIM21的参与来介导目标结合（AAV）和效应功能实现功能亲合力，展示了这些相互作用的多面性。

    综上所述Roche科研人员的这些发现揭示了TRIM21在抗病毒免疫中的双重作用，既识别、引导病毒进行细胞内降解，也展示了其在细胞内中和的病毒感染治疗中上的潜力。该研究推进了对细胞内免疫反应的理解，并为利用TRIM21独特结合模式开发抗病毒策略和创新设计开辟了新途径。

Reference:

Reusch J, et al. TRIM21 and Fc-engineered antibodies: decoding its complex antibody binding mode with implications for viral neutralization. Front Immunol. 2024 Jun 12;15:1401471.

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