基于肝星状细胞的糖酵解在空间上调节纤维性细胞外囊泡的释放和放大肝纤维化的研究

全世界每年约有200万人死于肝病和肝硬化。最近，大量研究人员致力于了解细胞和分子异质性如何促进肝纤维化向肝硬化发展。这种异质性包括一种特殊的肝星状细胞(HSC)亚群，它通过肝脏特定区域的高细胞外基质沉积来驱动肝纤维化。纤维化向肝硬化的进展是由于造血干细胞的激活，包括增殖、迁移和肌成纤维转化，初步研究表明，HSC活化与代谢重编程有关，包括通过糖酵解增强葡萄糖代谢，以满足高能量需求。研究表明，糖酵解酶的药理抑制可减少体内肝纤维化。

美国研究人员基于肝星状细胞的糖酵解在空间上调节纤维性细胞外囊泡的释放和放大肝纤维化的研究。在这项研究中，通过使用Apogee纳米流式、单细胞、空间、大量转录组学和蛋白质组学，证明了HSC特异性糖酵解在空间调节控制肝纤维化扩增的特定途径中的作用。更具体地说，研究发现造血干细胞中的糖酵解不是肝纤维化的结果，而是肝纤维化的驱动因素。此外，研究发现HSC特异性糖酵解通过表观遗传机制促进了纤维性中心周围区EVs相关基因的表达。最后，研究证明糖酵解依赖性EVs在体内放大肝纤维化，这是一种持续纤维化和肝脏疾病的机制。

在本研究中通过使用Apogee纳米流式仪和其他实验技术验证了血小板衍生生长因子-β（PDGF）介导的糖酵解促进EV释放的相关机制。EVs部分来源于多泡体(MVBs)的腔内囊泡(ILVs)。因此，检查了糖酵解对每MVB中ILVs数量的影响。实验分组除了对照外和糖酵解抑制剂-脱氧葡萄糖（2-DG）还有葡萄糖分别处理原代人造血干细胞。与对照相比，2-DG显著降低了MVBs中ILVs的数量，以及MVB标记物CD63的荧光水平（图6A）。葡萄糖的存在增加了从培养基中分离的EV标记物CD81的水平，当糖酵解被2-DG抑制时，该标记物被显著降低(图6B)。研究了PDGF介导的糖酵解如何影响EVs释放。本研究通过短发夹RNA (shRNA)敲除原代人造血干细胞中的己糖激酶2（ HK2），在mRNA和蛋白质水平上证实了这一点(图6C和D)。通过CD81蛋白水平和纳米颗粒跟踪分析(NTA)可以证明，与对照相比，PDGF增强了EV在media中的释放，而HK2敲除会消除这种释放(图6E)。考虑到糖酵解影响EV通路，我们选择RAB31作为模型，我们下一步研究RAB31在EV释放中的非典型作用。通过纳米流式细胞术检测，研究发现PDGF介导的EV释放在siRNA介导的RAB31敲低后被消除(图6F和G)。与这些结果一致，培养基中EVs组分中的EVs标记物CD81和肿瘤易感基因101 (TSG101)随着PDGF的增加而增加，并通过敲除RAB31而消失(图6H)。

               图6所示。PDGF介导的糖酵解通过RAB31促进EV释放

在这项研究中，通过使用Apogee纳米流式仪、单细胞、空间、大量转录组学和蛋白质组学，证明了HSC特异性糖酵解在空间调节控制肝纤维化扩增的特定途径中的作用。观察到HSC特异性糖酵解通过表观遗传机制促进了纤维性中心周围区EV相关基因的表达。最后，本研究提供证据证明糖酵解依赖的EV在体内放大肝纤维化，这是一种持续纤维化和肝脏疾病的机制（图8）。

图8所示。研究的总体图例

结论

造血干细胞中的糖酵解通过促进肝中心周围区纤维化性EVs的释放而放大肝纤维化。针对HK2或其他糖酵解酶的有效糖酵解药物抑制剂目前尚未在临床治疗肝纤维化中得到探索，这为药物开发确定了一个重要的研究领域。此外，Apogee纳米流式数据，空间转录组学数据集与单细胞和大量RNA-seq数据集相结合，可用于识别肝纤维化期间纤维化区上调和活化HSC的其他靶标。总之，抑制糖酵解酶如HK2和随后的表观遗传机制可能是治疗肝纤维化的靶点。

Summary

英国Apogee超灵敏纳米流式分析仪，专为外泌体微囊泡（EVs）等小颗粒分析优化设计，在EVs样品颗粒大小分析，绝对定量，多标记物同时快速分析工作中广泛应用。截止目前，该设备已累计参与数百篇高质量同行审议文章相关实验分析工作。其出色的灵敏度，稳定性及可靠性已备受业内广泛认可，并将继续为EVs相关基础研究及转化应用提供坚实支持。

Apogee纳米流式除了可用于纳米级别的颗粒 （如：细胞外囊泡、外泌体、微生物、病毒颗粒、LNP） 等，还可以用于作常规动物细胞检测 （如免疫细胞、哺乳类动物细胞、等）。它是一台全面且功能强大的纳米流式分析仪！

参考文献

Glycolysis in hepatic stellate cells coordinatesfibrogenic extracellular vesicle release spatially toamplify liver fibrosis
OXFORD BIOLOGY Methods & Protocols,Biology Methods and Protocols,2024, bpae009
Advance Access Publication Date: 13 February 2024
Methods Article: Biomolecular, Structural and Biophysical AnalysisA methodological primer ofextracellular vesiclesisolation and characterization via different techniques

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