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自动化核酸提取、检测和定量平台
From: Admin    Updated Time: 2014-04-24    Hits: 1194 人次

在现今分子生物领域中,样本的核酸提取、检测和定量已是每个实验室常用的实验手段。近年,实时定量PCR和第二代测序技术的诞生更令核酸提取的需求大大增加。这些新的核酸检测技术对核酸的纯度要求比较高,所以核酸提取的质量也比以前更受注重。另一方面,准确的核酸定量对于这些新技术,如第二代测序,起了成败的关键作用。因此,现今的核酸提取、检测和定量技术都跟以往有着重大的改变。

 

核酸提取

以往核酸提取是采用人手配合试剂盒去进行,由于是人手操作,通量较高的时候往往需要很长时间。而且,基于不同实验人员的经验和熟练程度有所不同,核酸提取的时间和纯度的一致性或许会有分别。面对这些问题,核酸提取的过程开始走向自动化操作以确保提取效果的稳定性。在经典核酸提取和纯化方法中,生物磁珠法最好。该技术是将纯化介质包被在纳米级生物磁珠表面,通过介质对核酸的吸附,在外加磁场下使核酸附着于磁珠定向移动,从而达到固液分离纯化的作用。因此,要实现核酸提取自动化,磁珠法是最好的选择。因为磁珠法的步骤可以完全在移液平台上进行,而且提取的纯度和产量高(每mg磁珠可吸附500μg DNA),并且可同时进行96个或384个样本核酸提取。这种方法开始在高通量的实验室受到重视。市面上有很多磁珠法的核酸提取试剂盒,它们大部份都可以跟移液平台结合起来。

 

核酸检测和定量

核酸提取以后,下一步就是检测和定量。对于下游进行第二代测序实验,这一步非常重要。如果定量不准确,会非常影响测序的结果,导致浪费了高昂的实验成本。传统的核酸检测是采用紫外分光亮度法,通过A260A280的比值来判定有没有蛋白质的污染。在TE缓冲液中,纯DNAA260/A280比值为1.8,纯RNAA260/A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8,故比值为1.8DNA溶液不一定为纯的DNA溶液,可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染,需结合其它方法加以鉴定。比较精确的方法有荧光定量PCR法和荧光染色法,如PicoGreenEBOligreen等方法,其中以PicoGreen荧光法最为方便和准确。PicoGreen是比较常见用作核酸定量的荧光染料之一,它能够结合双链DNA,具有非常好的特异性。PicoGreenDNA结合之后可以利用荧光酶标仪进行高通量测定。

 
 
 

核酸提取和检测的新趋势

为了解决通量和一致性的问题,核酸提取和检测需要更高效和准确的平台。伯齐科技同时引入了美国移液平台先驱-Apricot Desings公司的高通量全自动移液工作站和德国BMG Labtech多功能酶标仪,并联合成为自动化核酸提取、检测和定量平台。美国Apricot DesignsTPS系列是一个多功能的移液平台,它不但实现了自动化的移液工作,而且可达到非常好的准确度。在TPS平台上配合磁珠试剂盒便可进行自动化和高通量的核酸提取,最快可在40分钟内完成480个样本的核酸提取和纯化。除了核酸提取工作外,TPS系统还可进行多种实验,如PCR、板对板移液、梯度稀释、ELISA、等。因此,它非常适合高通量和多元化的研究单位。

 

TPS-EZ自动核酸提取平台

 

裂解:加入200ul样本、裂解液和蛋白酶K56度孵育10分钟

 

结合:加入100ul磁珠、异丙醇混匀后静置10分钟,间歇混匀5

 

吸附磁珠:将深孔板移至磁力架上,并吸弃上清

 

洗涤:分别加入洗涤液W1AW2洗涤磁珠,去除磁珠上的蛋白和盐分

 

洗脱:加入洗脱液Eluent A洗脱核酸,可以直接用于如qPCR等实验

 

核酸提取和纯化后利用紫外光吸引进行检测,找出比纯度较好的样本,再用PicoGreen荧光染色法进行准确定量。这个检测和定量的过程便会利用到吸收光和荧光检测,所以需要一台灵敏度高和稳定性好的多功能酶标仪作为检测工具。德国的BMG Labtech是一

家专业的高端酶标仪厂家,它的多功能酶标仪是欧美各大药厂的必备仪器。其中它的FLUOstar Omega型号具有独特的超速分光技术和高灵敏度的荧光检测光路,使其非常适合核酸的定量和检测。

1. FLUOstar Omega 220nm-1000nm全波长检测

 
FLUOstar Omega的超速分光计可以以每孔小于1秒的速度把全波长(220nm-1000nm)数据记录下来(图1),也就是一瞬间把 260nm280nm和所有波长的吸收值检测出来,并把A260/A280自动计算出来。而高灵敏的荧光检测光
2. 0.39-50pg/ul dsDNA标准曲线
路就可使PicoGreen的检测结果更准确,由于FLUOstar Omega的荧光灵敏度很好且检测范围很宽,从0.39pg50pg的核酸浓度都有非常好的线性结果(图2)。
 

因此,综合了Apricot DesignsTPS核酸提取仪和 BMG  Labtech  FLUOstar  Omega多功能酶标仪,伯齐科技可以提供一个全面、稳定、准确和自动化的核酸提取、检测和定量平台。结合这两个系统,高通量的核酸提取纯化和检测定量可以很方便简单地完成。目前为止,很多研究单位和大规模的测序机构都是利用我们这套平台去解决核酸提取和检测的问题。这也是高通量分子生物研究的一大趋势!

 

参考资料

 
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