药物筛选/分子生物学技术前沿：BMG & Promega合作推出活细胞CRISPR/Cas9基因编辑&NanoBRET实时监测助力PROTACs药物筛选
近年来，生物创新药研发药物靶标重点已从传统药物靶标，如G蛋白偶联受体，激酶和离子通道转向更具挑战性的“不可成药”重要靶标蛋白。
蛋白降解靶向嵌合体Proteolysis targeting chimeras (PROTACs)作为一种异双功能分子，因其可以利用天然的泛素-蛋白酶体途径选择性降解目标
蛋白，近年来成为新药研发重点关注新技术（图1）1。这对以往所谓“不可成药”药物靶标，如在重大疾病扮演重要角色的转录因子，骨架蛋白和
调节蛋白等非酶类重要蛋白，进行新方向药物开发具有重大意义。
图1，PROTAC介导的靶标蛋白泛素化降解过程示意图1
>PROTAC异双功能分子包括：可结合泛素连接酶E3的配体，可结合靶标蛋白的配体和连接两种配体的连接器Linker
>RROTAC与靶标蛋白和泛素连接酶E3形成三元复合物，进而可以引起靶标蛋白的泛素化
>泛素化的靶标蛋白通过细胞内天然的蛋白酶体系统降解。释放的PROTAC和泛素连接酶E3会被重新再利用
Megan Scudellari, Nature News，2019
然而，利用PROTACs进行新药研发，虽然前景被十分看好，并取得了越来越多的突破性成果，但是相关研发工作仍然存在大量分子设计与优化等挑战
性工作，包括深入了解PROTACs具体作用机制，设计优化出可更加有效介导靶标蛋白降解的PROTACs，选择合适的泛素连接酶及优化靶标蛋白泛素化等工作。
对此，BMG & Promega公司合作推出PROTACs相关药物研发新方案，通过BMG最新一代，超灵活，超灵敏，多功能酶标仪
CLARIOstar Plus-ACU，结合CRISPR/Cas9基因编辑和NanoBRET技术，在活细胞内实时监测PROTACs介导三元复合物的结合过程和靶标蛋白泛素化
与降解过程（图2）2。
图 2. A, PROTAC介导的靶标蛋白泛素化降解过程标注图；B, 在活细胞内，PROTAC介导三元复合物形成时，泛素链接酶偶联的荧光基团HaloTag与
靶标蛋白偶联的NanoBit荧光素酶形成NanoBRET反应发光信号。同样，可将HaloTag标记在泛素上，当偶联NanoBit荧光素酶的靶标蛋白被泛素化时，
可形成NanoBRET反应发光信号。
结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，可为不同蛋白添加HiBit标签。如通过为拥有巨大潜力的新药研发靶点BRD4蛋白添加HiBit标签，HiBit标签再可通
过和细胞稳定表达的LgBit重组形成NanoBit荧光素酶。配合质粒表达系统表达HaloTag标记的泛素连接酶VHL或泛素，可通过活细胞实现实时
NanoBRET监测，用于优化分析PROTAC介导的三元复合物结合情况与泛素化过程。
图 3. CLARIOstar Plus-ACU实时监测NanoBRET，分析PROTAC分子介导的BRD4和VHL三元复合物形成过程（A）和靶标蛋白BRD4泛素化实时过
程（B）。数据显示，PROTAC分子ARV-771在非常低的浓度即可有效介导三元复合物的形成及后续泛素化过程，整个过程可被该方案灵敏稳定地实
时监测分析。
然而，虽然PROTACs已经开发出很多成功的例子，但仍有大量优化工作要做。特别是很多PROTACs相关研发工作都是在特定时间点和特定浓度条件
下，进行相关的药物筛选。类似方案，不仅耗时耗力，并且结果难以精准预测。因为检测特定时间点问题，很多关键重要的生物学过程会被忽略。
考虑到泛素化介导蛋白降解过程的复杂性，能够结合活细胞实时分析PROTACs效力及其介导靶标蛋白的降解过程具有极其重要意义。Promega
公司研发人员结合BMG CLARIOstar-ACU，CRISPR/Cas9基因编辑技术和其特有的NanoBRET技术近来开发出一种新的方案，用于解决活细胞
内实时监测分析PROTAs介导靶标蛋白降解全过程（图4），相关文章已发表3。该方案通过活细胞实时监测，不仅可分析靶标蛋白最大降解程度，
最大程度降解时间，蛋白降解逆转过程等信息，同样可为分析泛素化过程，PROTACs介导的三元复合物结合强度与稳定性，泛素连接酶特异性
选择，PROTACs分子优化设计，药物分子优化设计等工作提供重要参考信息，可为基于PROTACs进行创新生物药研发提供具有重大应用价值
的解决方案。
图4文章“Quantitative Live-Cell Kinetic Degradation and Mechanistic Profiling of PROTAC Mode of Action”图文摘要
德国BMG最新一代多功能酶标仪CLARIOstar Plus ACU：标配专利线形渐变滤光片光栅LVF技术，拥有市场荧光/发光检测灵敏度和灵活性的最佳整
合。同时，在发光检测灵敏度，孔间干扰控制，顶读/底读自动聚焦检测等综合方面具备最佳性能。配合最灵活精密的气体调控技术，可为基于活细
胞相关荧光和发光实验分析提供最佳解决方案。曾先后在多种应用方案中获得Promega公司认可推荐或用于其相关研发工作中：
Promega NanoBRET活细胞实时分析助力PROTACs药物研发所用机型：
NanoBRET技术唯一获得Promega认可的光栅（LVF）检测机型：
Promega活细胞实时分析细胞状态方案推荐机型：
参考资料：
1，Megan Scudellari, An emerging class of drug could send some of medicine’s most troublesome protein targets to the cellular rubbish bin. Nature News，2019
2，Kristin M. Riching, . et al. Promega, Madison, WI, U.S.A，BMG Application Note 2020
3，Riching, K.M. et al. Quantitative Live-Cell Kinetic Degradation and Mechanistic Profiling of PROTAC Mode of Action.
ACS Chem. Biol. (2018) 13: 2758-2770.
