引言

朊病毒是一类会引发人类和动物脑部蛋白质异常折叠的可传播病原体。感染会导致脑损伤，且往往是致命的。此类神经退行性疾病的实例包括羊瘙痒症、疯牛病（牛海绵状脑病）和克雅二氏病。

以前，研究朊病毒需要进行长时间的生物测定，对受感染的动物进行长时间（1-6 个月）的研究。这种方法既费时，而且饲养感染动物的成本也很高。蒙大拿州汉密尔顿的落基山实验室研究开发了一种新的朊病毒接种测定法，称为实时震荡诱导转化测定法（RT-QuIC），可对受感染样本中的朊病毒水平进行终点定量测定。与以往的方法相比，这种检测方法速度更快，通量更高。该测定可在短短 20 小时内完成，其灵敏度不亚于甚至高于全动物模型。

BMG LABTECH的FLUOstar Omega是唯/一具备长时间震荡和培养微孔板的酶标仪，这得益于其坚固的“德国制造”结构。RT-QuIC样本每隔15分钟测量一次，共计20-68小时，期间交替震荡1分钟和静置1分钟。我们开发了一个软件脚本，用于控制激活测定所需的振荡和静置时间。

检测原理

RT-QuIC 检测法用于估算朊病毒接种的相对数量。该检测法通过测量样本的连续稀释，统计估算接种剂量（SD）。在该检测中，极少量的传染性朊病毒会被添加到正常的朊病毒蛋白中，从而引发或导致朊病毒蛋白发生类似疾病的错误折叠。测定方法是通过测量样本的系列稀释度并确定接种活性损失（SD50），即终点稀释度来进行量化。

实验步骤

在整个 20-68 小时期间，仪器设置为在 42°C 下恒温孵育。实验编写了两个测试运行协议的脚本。第一个协议设置为振荡板一分钟，然后静置一分钟；第二个协议设置为每 15 分钟使用底部光学镜进行一次荧光终点测量。荧光染料硫黄素 T（ThT）被用作朊病毒接种标记。将 ThT 添加到重组朊病毒蛋白中，当发生聚合反应时，ThT 就会与朊病毒蛋白结合，从而导致荧光随着时间的推移而增加。

仪器设置

荧光终点 - 底部读数

分析

斯皮尔曼-凯伯（Spearman-Kärber）分析法与生物测定的 50%致死剂量（LD50 ）类似，用于估算每克组织中50%的孔出现硫黄素T（ThT）阳性反应的播种剂量或稀释倍数（SD50/g）。在进行 Spearman-Kärber 分析时，选择的稀释系列中至少有一个稀释度的 ThT 阳性率为 100%，以及一个稀释度的 ThT 阳性率为 0%。

结果与讨论

使用软件脚本对RT-QuIC检测进行了20至68小时的测量，数据取自8个重复孔的相对荧光单位平均值。每个图表仅显示每45分钟的数据。

FLUOstar Omega酶标仪除了线性振荡和轨道振荡外，还能以独特的双轨道振荡模式进行振荡。在整个测量期间，孵育温度保持在42°C。Omega系列的高品质设计和坚固的制造使研究人员能够连续测量数天，而不会中断振荡或产生温度波动。数据被不间断地收集并输出到BMG LABTECH的数据分析软件（MARS）和Excel中。

图 1 和图 2 展示了 RT-QuIC 检测法与仓鼠豚鼠脑匀浆（BHs）的关系。图 1 使用的是接种后 80-85 天（DPI）的仓鼠脑匀浆样本，而图 2 使用的是接种后 10 天的仓鼠脑匀浆样本。

图 1：RT-QuIC 灵敏度：对 263K 仓鼠脑匀浆稀释液的分析。

50% 接种剂量（SD50 ）是指在半数重复孔中产生足够增强的 ThT 荧光的量。在本例中，用 10E-9 稀释的刮伤病 BH 储存液（深蓝线）的 2 μl 等分试样（接种量）就能达到近似的 SD50 。因此，Spearman-Kärber 估计的 SD50 /2μL 为 10E9.1，SD50 /g 为 10E12。该 SD50 的对数（~11）与生物测定中发现的 LD50 的对数（~10）非常吻合。

图 2：对三种 263K 接种临床前注射后 10 天的仓鼠 BH 进行 RT-QuIC 终点稀释分析。

在此情况下，约50%的播种剂量（SD50）通过2 μl的10E−5稀释度的瘙痒症接种后10天263K BH原液（绿色曲线）实现。其SD50/2μL为10E5.5，SD50/克组织为10E8.2。

正如预期，接种后85天（DPI）样本的SD50/克组织（10E12）高于接种后10天的样本（10E8.2），因为有更长的发病时间。这些RT-QuIC结果与生物测定结果高度相关。数据表明，RT-QuIC检测可视为一种比整动物生物测定更快速、更高通量的替代方法，同时也表明接种后仅十天的动物样本即可用该方法进行检测。

结论

多功能酶标仪

使用RT-QuIC检测法和酶标仪可以更快、更高效地测量朊病毒接种。一些已证实可用RT-QuIC检测的传染性海绵状脑病包括仓鼠和绵羊的痒病、鹿的慢性消耗性疾病、克雅氏病（CJD）和牛海绵状脑病（BSE）。这种检测方法比以往的生物检测方法更快、更灵敏。BMG LABTECH的Omega系列酶标仪功能强大且坚固耐用，能够承受这种检测方法所需的连续多日高速震动。

使用FLUOstar Omega的优势包括：

• 更快、更高通量的朊病毒接种监测检测方法

• 先进的酶标仪功能，包括震动和温度控制，是检测有效性的关键

• 20-68小时内每15分钟进行一次荧光底部读数测量

有关RT-QuIC检测的更多详情，请查看科学讲座“优化RT-QuIC检测的灵敏度和特异性”。科罗拉多州立大学的Davin Henderson博士在此分析了使用RT-QuIC检测朊病毒时需要考虑的重要因素。

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