Cell-based assays（CBA）为获取复杂且与生物学相关的数据铺平了道路。它们可用于量化复合物的细胞毒性、生化机制、生物活性和非靶标相互作用——在某些情况下甚至可以同时进行。然而，CBA的巨大潜力可能需要更多的实验计划和准备工作。在测量CBA时，通常会有一些额外的考虑，而传统的生化检测则不会遇到这些问题。这些考虑可能包括检测实施和评估方面的差异。本文将重点介绍CBA中可能面临的一些障碍，并提出一些克服障碍的方法。

图1：微孔板中的贴壁细胞代表异质性样本。

使用BMG LABTECH的Atmospheric Control Unit（ACU）时，除了可用的温度控制外，您还可以控制读数器内的CO₂和O₂气体浓度。这可以将您的酶标仪转变为细胞培养箱，并可以在保持细胞活力的前提下进行为期几天的活细胞动力学实验，从而使基于细胞的实验结果更具生理学意义。

在本文中，我们将仔细研究基于细胞的检测的异质性。我们将强调许多细胞样本的异质性所带来的问题，并提供一些潜在的解决方案和工具。大多数体外细胞培养物在进行微孔板读数时都是异质性样本，不过也有一些基于细胞的检测方法，如 alamarBlue™ 或 CellTiter-Glo® ，上清液中的染料是均一的。如图1所示，贴壁细胞只能形成薄薄的一层。在异质CBA中测量细胞内靶标或细胞膜上的靶标时，与均质液体样本相比，需要考虑更多因素。

焦距高度

最佳焦距是指酶标仪可以探测样品最高信号强度的平面。如果测量样品时焦距不当，会对数据质量产生负面影响。大多数体外细胞模型都依赖于贴壁细胞培养。细胞通常在微孔板孔的平面底部培养。为了便于细胞附着，微孔板材料通常经过处理，使其表面生成极性基团，或者涂覆细胞天然细胞外基质的成分。细胞单层的探测存在一个问题：酶标仪上的探测高度必须与样品的焦平面对齐，以提供最大的信号。BMG LABTECH软件会自动生成焦距高度曲线，以图形方式显示不同焦距下的信号强度（图2）。如图所示，如果焦距偏离最佳焦距哪怕只有一毫米，荧光强度就会迅速下降。

图2：读数器控制软件提供的不同焦距高度下的信号强度曲线。

另一方面，当探测的焦平面过多地进入细胞上方的溶液时，信噪比（S/B）才会降低（图3）。在无法确定的情况下，建议使用较低的焦距高度，而不是较高的焦距高度。在BMG LABTECH酶标仪上，当从微孔板上方或下方读取时，焦距可以调整和优化，这意味着用户可始终受益于使用最佳焦距所带来的检测质量的提高。

图3：信噪比（S/B）取决于所使用的焦距高度。通过底部光学器件在不同焦距高度下测量孔，并从不同焦距高度的荧光信号强度中计算S/B。

在开始测量前，建议先进行焦距调整。理想情况下，在细胞数量多且预期信号高的孔中进行焦距调整。如果您知道信号强度和S/B比通常较低，请在测量前额外接种一个孔，并用PBS覆盖，以最大限度地提高可用的S/B比。使用该孔进行焦距调整。

由于贴壁细胞位于微孔板的底部，因此焦距的最佳值应在0至3毫米之间。单个焦距取决于所使用的微孔板及其底层的厚度。

孔扫描的重要性

贴壁细胞除了在培养基的 Z 平面上有明显的分布外，通常在 X/Y 平面上也有不同的分布。如果只从中间进行测量，结果可能会严重失真。细胞可以分布在培养基底的任何位置，而且在大多数情况下分布不均。特别是在细胞密度较低或只有亚群包含目标时，很可能整个孔的细胞信号通路分布不均。通常情况下，微孔板测量是在每个孔的中心进行的。

在 BMG LABTECH 微孔板酶标仪上进行标准荧光测量时，每孔中心会有 20 次闪烁，然后读取相应的发射值。结果为这 20 个测量点的平均值。细胞可能不会均匀分布在孔表面。例如，它们可能并不集中在孔的中心，而在边缘沉积。如果只从中间测量荧光表达细胞，结果可能会严重失真。为了解决这个问题，BMG LABTECH 为其酶标仪提供了不同的孔扫描选项。除了在孔中心进行传统的测量外，还可将单个测量点以轨道或螺旋扫描模式遍布整个孔底 (图 4)

 图4：BMG LABTECH的孔扫描选项包括轨道、螺旋和矩阵扫描以及中心测量。

这样，整个孔表面可以覆盖多个测量点，从而获得更可靠、更具代表性的测量结果，并提高重复测量之间的可再现性。此外，矩阵扫描选项可根据数据点矩阵对每个孔进行多次测量。这提供了整个孔内信号的局部分辨率，从而提供了监测接种均匀性和目标信号局部变化的机会。使用矩阵扫描选项时，读数器在每个孔中进行多次测量，分辨率高达900点/孔（30 x 30数据点矩阵）。BMG LABTECH的软件可以以图形方式显示每个扫描点，为每个孔创建3D热图。

如果细胞密集且分布均匀，则中间读取和扫描选项都能获得相似的结果。然而，如果样品不均匀，则可以使用扫描选项来补偿孔内的任何变化。图 5 显示了表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的苔藓细胞的矩阵扫描。该扫描显示了孔内信号或细胞的异质分布，如果只在孔中心进行测量，则无法检测到这种异质分布。矩阵扫描功能还能让您从评估中排除单个点或整个区域。

图5：使用25 x 25矩阵扫描和底部光学元件获得的GFP表达苔藓细胞的矩阵扫描。颜色表示信号强度，从低（紫色和蓝色）到高（红色）。

图6显示了使用孔中心和扫描选项测量的10个重复。当使用所有扫描选项时，变异系数（以%CV表示）会大大降低，而矩阵扫描可获得最佳结果。由于螺旋平均法可以覆盖更大的孔区，因此与轨道平均法相比，数据会略有改善。

图6：孔扫描可降低数据变异系数（%CV）。使用底部光学器件和不同的孔扫描选项测量细胞。每个扫描选项均显示孔中心测量数据的变异系数（%CV）降低。

结论

异质细胞样品的荧光测量主要建议总结如下：

• 处理贴壁细胞时一定要调整焦距。

• 贴壁CBA通常受益于孔扫描模式的应用，以校正孔中异质信号分布。

• 矩阵扫描功能可让您获得整个孔内信号的局部分辨率，从而有机会监测接种的均匀性和目标信号的局部变化。

• 矩阵扫描功能还使您能够从评估中排除单个点或整个区域。

   

转载自：BMG LABTECH

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