本研发现纳米流式仪在细胞外囊泡(EV)分析时抗体滴定对实验结果是很重要的，可以确保在EV群体中使用最佳浓度的抗体来量化其抗原标志物，并产生准确和可重复的结果。使用浓度不足的荧光抗体不能充分染色EV抗原位点，导致高于基线的荧光信号检测不理想。相反，抗体浓度过高可导致抗体上荧光标记的潜在聚集、非特异性结合或背景信号增加。这些情况会阻碍微弱的阳性信号的检测，使准确性受到影响。

加拿大科研人员研究发现抗体滴度对纳米流式分析细胞外囊泡结果的重要影响研究。本研究使用Apogee A60 Microplus对血小板作为细胞替代品和血小板衍生颗粒作为EV群体的替代品，展示了抗体滴定过程，突出了一些关键的分析参数，这些参数可能会使进入EV研究领域的新研究人员感到困惑和惊讶，证明了纳米流式仪和抗体滴度对实验结果的重要影响。

所有样品均使用Apogee A60 MicroPlus平台进行分析，实验结果展示了仪器的灵敏度和分辨率方面的优势。实验结果分别用散点图和峰形图来展示实验结果，并且说明每个图的具体样品。(A-D)用于进一步评估平台的成熟度，并提供可识别的尺寸参考范围(80 nm聚苯乙烯- 1300 nm二氧化硅)。(E-G)说明真实珠01 A，B和有机硅珠的分辨率。(H)在没有样品、抗体、膜染色剂和洗涤剂的情况下，显示仪器和稀释剂的清洁度。(I-L)血浆样品的散点图。(I)血浆中加入抗体CD41a-APC散点图 (J)，血浆，抗体和添加CFDA-SE膜染料散点图(K)，血浆，抗体散点图(L) CFDA-SE膜染料和Triton X-100洗涤剂散点图。

(Fig.4)

血浆是最广泛用于疾病生物标志物评估的液体活检之一。图5展示了Apogee A60 Micro plus 在血浆样本的数据。从结果可以看出CD41a阳性表位的信号强度逐渐增加，从上到下是五种不同偶联CD41a抗体，抗体浓度从左到右增加的结果。对于每个偶联物，在每个散点图的右上角检测到一个独特的完整血小板群。随着抗体浓度增加在基线上方明显出现第二群CD41a阳性pdp (散点图中心)。通常用微流式细胞术检测许多抗体的非特异性结合，CD41a-SuperBright436滴定的上显示了这样一个群体(蓝色圆圈)。不同的荧光偶联抗体由高到低依次为405 nm激发(eFluor450、SuperBright436)、488 nm激发(FITC)、561 nm激发(PE)和638 nm激发(APC)（Fig.5）。

（Fig.5）

比较不同荧光偶联物在最佳抗体浓度下对(A)阳性染色血小板和(B) pdp的检测。不同偶联抗体的完整血小板检测浓度相似，但pdp检测浓度随着荧光团相对亮度的增加而明显增加。当使用最佳抗体浓度时，无论选择何种偶联物，检测到的完整血小板的浓度都是相似的。相比之下，pdp的检测浓度随着偶联抗体亮度的增加而显著增加。每个欧联抗体的相对亮度提供了将离散的阳性信号移动到“噪音”或阴性背景阈值之上的能力，并被计算为一个“事件”。随着EV尺寸的减小，潜在可用抗原的比例减少，因此信号的相对强度也相应降低。因此，当粒子群变小时，粒子本身或探测表面抗原的信号强度最终会合并到负的粒子群中。这也意味着更亮的偶联物可以使更大比例的小粒子越过检测阈值。此外，欧联物的大小可以给粒子增加显著的粒径测量值，从而增加粒子穿越仪器的光散射检测阈值的能力。

结论：由于各种技术原因，用于分析EV表面抗原的抗体滴定具有挑战性。必须非常小心地确保仪器和试剂在合理范围利用。完整分析MFI、浓度、分离或染色指数数据是非常有益的，而简单地将相同的细胞分析程序转换为EV分析可能会导致重大问题。使用标准化的方案来定义实验的最佳抗体浓度将会提高数据质量。

英国Apogee超灵敏纳米流式分析仪，专为外泌体微囊泡（EVs）等小颗粒分析优化设计，在EVs样品颗粒大小分析，绝对定量，多标记物同时快速分析工作中广泛应用。截止目前，该设备已累计参与数百篇高质量同行审议文章相关实验分析工作。其出色的灵敏度，稳定性及可靠性已备受业内广泛认可，并将继续为EVs相关基础研究及转化应用提供坚实支持。

Apogee纳米流式除了可用于纳米级别的颗粒 （如：细胞外囊泡、外泌体、微生物、病毒颗粒、LNP） 等，还可以用于作常规动物细胞检测 （如免疫细胞、哺乳类动物细胞、等）。它是一台全面且功能强大的纳米流式分析仪！

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