哈尔滨医科大学科研人员应用DC细胞来源的外囊泡通过加载BMP87-99A91作为诱导CD4+ T细胞介导的神经保护性免疫治疗脊髓损伤疫苗的研究

脊髓损伤(SCI)是一种严重的中枢神经系统(CNS)损伤,由于神经回路的破坏而导致严重的神经功能障碍。脊髓损伤后的病理生理进展涉及免疫反应,而CD4+T细胞是损伤后免疫反应的重要组成部分，CD4+T细胞不同亚型之间的平衡对神经保护至关重要。但是在脊髓损伤后的免疫应答中，大多数CD4+ T细胞偏向于辅助性T细胞1 (Th1)和辅助性T细胞17 (Th17)。它们会诱导炎症细胞因子和抗体的释放增加，会加重神经元丧失、髓鞘形成和轴突损伤，而Treg/Th2细胞通过分泌抗炎细胞因子在脊髓损伤后提供保护和促进恢复的重要作用。改变T细胞亚群成为一种有希望的治疗脊髓损伤的策略。

哈尔滨医科大学科研工作者利用DC细胞来源的外囊泡通过加载BMP87-99A91肽作为诱导CD4+ T细胞介导的神经保护性免疫治疗脊髓损伤疫苗的研究。本研究根据树突状细胞(DC)衍生的细胞外小囊泡(DsEVs)可以有效地刺激T细胞活化和髓鞘碱性蛋白(MBP)的变异肽配体(APLs)可以影响CD4+ T细胞亚群并降低神经炎症水平特性的特点,使用高分辨率的纳米流式仪Apogee A60-Universal分别检测：1)DC细胞和DsEVs对BMP87-99A91肽的加载效率 ;2)在混合淋巴细胞反应系统（MLR）中A91-DsEVs对共培养CD4+ T细胞极化的影响;3) 纳米流式细胞仪检测各A91-DsEVs对小鼠脾CD4+T细胞极化的调节能力。实验证明A91-DsEVs介导的微环境具有促进轴突再生、神经元保护、促进髓鞘再生，从而支持脊髓损伤模型小鼠运动功能恢复的作用（Fig.1）。

Fig.1

研究人员从C57BL/6小鼠(6-8周龄)股骨中分离的骨髓细胞在完全培养液中培养,培养至第6天收集细胞作进一步分析。接着在培养基中加入TAT47-57-MBP87-99A91或TAT47-57-OVA抗原。24 h后更换为不含外泌体的完全培养基。孵育24 h后，收集上清液作进一步分析。使用超灵敏纳米流式细胞仪（Apogee A60-Universal, UK）检测MBP87-99A91肽在DC和DsEVs上的加载效率。结果表明，MBP87-99A91肽(FITC标记)成功加载到DC细胞(粉色)和A91-DsEVs(绿色)中，加载率分别为95.1%和67.9%(Fig.2)。

Fig.2成功从DCs培养基中分离出A91-DsEVs。

为了评估A91-DsEVs被DC和CD4+ T细胞内化的情况，本研究使用1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚碳氰碘(Dil)标记A91-DsEVs。然后将Dil标记的A91-DsEVs与DC和CD4+ T细胞分别共培养。A91-DsEVs (橙色荧光显示)被DC和CD4+ T细胞内化（Fig.3a）。A91-DsEVs治疗组和OVA-DsEVs治疗组DCs的存活率远高于DsEVs治疗组和PBS治疗组。同样，A91-DsEVs治疗组和OVA-DsEVs治疗组的CD4+T细胞活力高于PBS治疗组(Fig.3b)。流式分析A91-DsEVs，DsEVs和PBS处理组，A91-DsEVs处理组DC中MHC II和CD80的表达更高,CD86表达明显升高(Fig.3c)。流式细胞术检测混合淋巴细胞反应系统脾脏CD4+ T细胞的细胞亚型变化。结果显示，A91-DsEVs治疗组IFN-γ+ CD4+T和IL-17A+ CD4+ T细胞计数降低，Foxp3+ CD4+T和IL-4+ CD4+ T细胞计数升高（Fig.3d）。这些发现表明，A91-DsEVs在体外增加DC抗原呈递能力和调节CD4+ T细胞向Th2和Treg亚型分化的潜力。

Fig.3

为了进一步分析A91-DsEVs对体内脾脏CD4+T细胞极化的影响，用流式细胞术在3 dpi时从不同组小鼠中分离脾脏T细胞，用流式细胞术测定脾脏CD4+ T细胞的亚型。A91-DsEVs治疗组显示IL-4+CD4+和CD25+Foxp3+CD4+T细胞计数增加，IFN-γ+ CD4+T和IL-17A+ CD4+ T细胞计数减少(Fig.4b)。。这一结果证实了A91-DsEVs免疫脊髓损伤小鼠可以调节CD4+T细胞向Th2和Treg抗炎表型的极化。

Fig.4b

为了证明A91-DsEVs刺激脾脏CD4+T细胞向损伤部位募集的能力，本研究提取了不同DsEVs组或PBS处理后的小鼠脾脏CD4+T细胞。这些细胞用Dil染料标记，然后通过尾静脉注射注入脊髓损伤小鼠。注射24 h后进行的荧光示踪分析显示，与其他组相比，A91-DsEVs处理小鼠脊髓内的Dil荧光强度更高(Fig.5c)。Dil荧光在脊髓和肺中的强度明显高于其他器官。在7 dpi时对脊髓进行免疫荧光检测，结果显示A91-DsEVs治疗组的CD4+ T细胞募集到病变区域的数量多于其他组(Fig.5d)。这些结果表明，A91-DsEVs刺激的CD4+ T细胞可能向脊髓损伤部位迁移。

Fig.5

结论：本研究表明，A91-DsEVs诱导抗原特异性CD4+T细胞归巢到损伤部位，建立保护性免疫微环境，促进脊髓损伤小鼠的功能性运动恢复。研究结果表明，DsEV疫苗接种策略可能有助于治疗中枢神经系统创伤或炎症性疾病。

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