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2023-08-15

BMG使用小贴士（三）：如何优化微孔板读板机测量的焦距？

你知道吗？
BMG LABTECH读板机的焦距设置范围为0-25毫米（底部光学器件为0-9.7毫米）。这个距离是从微板的底部或顶部测量的，这分别取决于使用的是顶部还是底部光学器件。

用相机或手机拍照时，保持焦点以获得最佳效果很重要，对吧？同样的道理也适用于微孔板读板机中的光学系统！此How To Note将重点介绍焦距设置，使您能够调整微孔板读板机的焦点。

在微孔板读板机中，焦距被定义为检测系统和微孔板（即样品）之间的距离。最佳焦距指示微孔板读板机可以检测样品的最高信号强度的平面。使用非最佳焦距进行测量会对结果产生负面影响。

图1：微孔板读板机上的焦距曲线

不同型号的微孔板读板机和来自不同制造商的读板机的功能各不相同：焦距可能不可调节，可能必须手动输入，也可以自动确定。没有焦距调节的仪器通常是灵敏度有限的入门级设备。具有手动焦距设置的装置需要一些试验和试错来凭经验确定特定测定的最佳高度。在测量前进行焦点调整的微孔板读板机自动识别特定样品或一组样品的最佳焦距（图1）。一旦确定，您可以在体积和微孔板类型保持不变的情况下使用与之前测量相同的焦距。

你知道吗？
从底部读数时，焦距取决于使用的微孔板和其他因素，包括其底层的厚度。

由于液体样品的物理性质，信号强度通常在样品的液体表面下方稍低的地方达到最高。微孔板读板机将通过识别具有最高信号强度的平面来相应地确定最佳焦距。增加焦距将使光学焦点在液体表面上方移动。相反，减小焦距将使光学焦点向微孔板底部的方向移动。在这两种情况下，样品的信号强度将降低，信号与空白的比率（图2）和测定窗口将降低。

图2：焦距设置对信噪比的影响

在本案例中，在不同的焦点高度测量100nM的荧光基团标准样品和空白样品，计算并绘制了相应的信噪比（S/B）与焦距的关系图。自动焦距调节产生了9.3mm的最佳焦距，并获得了所有测试结果的最佳S/B值。当偏离确定的最佳值时，S/B值显著降低。

值得注意的是，不同应用的最佳焦距可能不同，它取决于平板类型、加样体积和测定类型。例如，当测量粘附细胞样品时，信号强度通常位于微板孔的底部。

次优焦距设置不仅会影响测量样本的信号强度。它也会影响数据变化（图3）。与使用非最佳焦距时会降低的信号与空白比相比，样品重复之间的变化（%CV）会增加，从而进一步降低测定的读数质量。

焦距设置也会影响数据点的变化。为了强调这一原理，我们计算了在不同焦距下三个重复的测量的100nM荧光基团标准样品的%CV值。如图3所示，在微孔板读板机确定的最佳焦距9.3下进行测量时，获得了最低的%CV值。在偏离该最佳值的焦高处的测量导致更大的变异。虽然对于低于最佳高度的焦高，%CV的增加不明显，但与最佳条件相比，使用高于9.3mm的高度导致%CV显著增加高达3%。

图3：焦距设置对数据变化的影响

你知道吗？
通过在具有EDR功能的BMG LABTECH微孔板读板机上开始测量时选择自动对焦，读板机可以自动识别具有最强信号的样本，并调整该孔的焦距。

你知道吗？
BMG LABTECH的线上文档库包含各种各样的应用说明，这些说明突出了我们的微孔板读板机上常用分析的性能，并为读板机设置提供了建议，包括焦距。

如何在BMG LABTECH阅读板机上调整焦距

在“开始测量”窗口中选择测试程序后，可以调整BMG LABTECH读板机的焦距。只需选择一个要进行焦点调整的样品孔（或多个孔），选择“新焦距”或“自动对焦”（如果可用），然后单击“开始调整”按钮。

正如你所看到的，将微孔板读板机设置调整到适当的焦距对于获得最佳结果至关重要。然而，这样做的先决条件是，必须将板上样品孔的加样体积差异保持在最低限度。

由于最佳焦距是根据一个样品孔的加样体积确定的，因此孔之间的体积差异，无论是由于移液误差无意造成的，还是由于不同体积的移液有意造成的，都会改变结果。如以下示例中所强调的（图4），即使孔之间的几微升差异也会导致测量信号强度的显著变化。

在本案例中，将不同体积（10至30μL）的10nM荧光基团标准品分配到微孔板的不同孔中。在具有15μL样品体积的孔上进行焦点调节。随后用获得的设置测量所有样品，并将测量数据相对于来自15μL孔的测量数据进行归一化。如图4所示，在加样量较低或较高的孔上使用15μL体积的最佳焦距将导致显著偏差。即使样品体积只有2.5μL的微小差异也会导致信号强度出现20%的偏差。在某些情况下，这甚至可能导致信号的增加，这是由于在具有更高样品体积的孔中包含的分析物的总量更高。