Roche公司如何利用SPR及单分子质量光度系统解码复杂的抗体结合模式及其对病毒中和的影响
TRIM21是一种已知的胞质Fc受体,在抗体介导的细胞内免疫中起着重要作用。之前的研究表明TRIM21与抗体的Fc区域结合,能够中和已经进入细胞的病毒,并通过泛素-蛋白酶体系统将其靶向降解,但是具体的工作机制还不是非常清楚。
Roche研发人员最近的工作发现了TRIM21识别、结合并促进抗体包被病毒的蛋白酶体降解的能力,在很大程度上依赖于其与抗体Fc区域相互作用的亲和力(Affinity)和功能亲合力(Aidity)。 经过一些列测试后研究人员提出了一种新的结合机制,TRIM21与一个Fc位点的结合导致PRYSPRY从螺旋卷曲域上脱落,由于其柔性连接链增加了流动性,从而促进了Fc第二个位点的结合,这种双价结合产生了功能亲合力(Aidity)。
为了研究TRIM21与IgG的结合动态,研究人员首先采用两种重组TRIM21构建体,同时构建了包含PRYSPRY和卷曲螺旋结构域的TRIM21-CC-PS的结构,来模拟TRIM21的天然二聚体状态。然后通过SPR的方法测试TRIM21与一系列human IgG1 (mAb1)突变体的亲和力。
Interaction analysis of human IgG1 (mAb1) Fc variants and TRIM21 PRYSPRY domain
实验结果展示了抗体Fc端具有双价态结合功能可以与两个TRIM21结合,利用单分子质量光度系统不但可以确认SPR的测试结果,而且由于TRIM21天然形成同源二聚体具有比传统1:1相互作用更为复杂的结合模式,质量光度系统具有更大的优势来测定结合化学计量比。
大多数抗体构建体对PRYSPRY的亲和力是相似的,但是结合界面的关键残基上含有Fc突变的变体YTE(M252Y, S254T, T256E)、HH(T307H, N434H)和Y436A,对PRYSPRY结构域的亲和力比野生型(WT)更低一些,结合强度顺序如下:WT具有最强的亲和力,其次是YTE,然后是HH,Y436A的亲和力最弱。研究人员还发现Y436A与野生型相比亲和力降低了180倍,SPR和单分子质量光度系统(MP)结果揭示了PRYSPRY-IgG的化学计量比为2:1,且没有表现出任何结合协同性,没有显示Fab结合的额外贡献。
Mass distribution of Fc WT / cytokine-Fc Fusion WT / cytokine-Fc Fusion WT-AAA
Mass distribution of cytokine-Fc Fusion WT / WT-AAA / Y436A
研究人员随后进一步确定了TRIM21-CC-PS二聚体的状态,二聚体结构的预期理论分子量是86千道尔顿。体积排阻色谱-多角光散射(SEC-MALS)显示,94%的颗粒质量约为90千道尔顿。质量光度测量(MP)显示99%的颗粒重量为82 ± 13千道尔顿。电子显微镜分析揭示,PRYSPRY结构域彼此相对,卷曲螺旋结构域在中间介导其二聚体化。
Dimer of TRIM21-CC-PS determined by MP and EM
为了深入研究TRIM21-CC-PS与抗体Fc的结合模式,研究人员进一步采用了单分子质量光度系统和EM两种技术。在MP测量中,将不同浓度递增的TRIM21-CC-PS与三种抗体Fc变体(mAb1 WT、mAb1 WT-AAA和mAb1 AAA)分别以不同的摩尔比例孵化。将TRIM21-CC-PS与mAb1混合后,出现了大约80 kDa和140 kDa的峰,分别代表未结合的TRIM21-CC-PS和mAb1。在大约230 kDa处出现了第三个峰,其分子量对应于由一个TRIM21-CC-PS和一个mAb1 WT组成的复合物。随着TRIM21-CC-PS浓度的增加,平衡向结合物种转移直到几乎所有的抗体都被结合。在TRIM21-CC-PS的10倍摩尔过量下,24%的TRIM21-CC-PS和mAb1 WT结合,揭示了1:1的化学计量比,其中一个二聚体同时与两个IgG重链结合。在低纳摩尔浓度下检测TRIM21-CC-PS与mAb1 WT的相互作用,也使研究人员洞察到了二聚体结合导致的强烈相互作用,进而实现功能亲合力(Avidity)结合模式。
另外,mAb1 WT-AAA浓度显示了很小一部分结合分数(约2%),而AAA变体则没有形成复合物。有意思的是研究人员预期mAb1 WT-AAA变体会有结合,但是实验中只观察到两个Fc重链中的一个结合导致了亲和力变弱,而对称的AAA突变完全取消了TRIM21的结合。值得注意的是,数据表明TRIM21可以通过与一个结合位点与A20抗体的两个不同Fc区域的同时相互作用,从而最终诱导AAV颗粒聚集。
Investigate the TRIM21-CC-PS - Antibody Fc binding mode by MP
在低纳摩尔浓度下检测到TRIM21-CC-PS与mAb1野生型之间的相互作用,正如在AlphaFold模型(Uniprot ID P19474)中所观察到的,PRYSPRY结构域通过一个柔性连接链附着在其螺旋上。这个连接链可能通过将PRYSPRY结构域彼此拉近,允许二聚体结合。
最后,研究人员探索了TRIM21与重组腺相关病毒载体(rAAVv)颗粒之间的相互作用,发现通过TRIM21的参与来介导目标结合(AAV)和效应功能实现功能亲合力,展示了这些相互作用的多面性。
综上所述Roche科研人员的这些发现揭示了TRIM21在抗病毒免疫中的双重作用,既识别、引导病毒进行细胞内降解,也展示了其在细胞内中和的病毒感染治疗中上的潜力。该研究推进了对细胞内免疫反应的理解,并为利用TRIM21独特结合模式开发抗病毒策略和创新设计开辟了新途径。
Reference:
Reusch J, et al. TRIM21 and Fc-engineered antibodies: decoding its complex antibody binding mode with implications for viral neutralization. Front Immunol. 2024 Jun 12;15:1401471.
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