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简介：您是否想知道：是否改变纯化方法会影响检测到的EV分离物的生物活性，或者甚至是他们的装载货物或标记？阅读下面的内容，你就会知道这就是为什么。

        方法很重要。更改工艺流程中的一件事可能完全改变您的结果。 这对于细胞外囊泡(EV) 分离和其他技术来说都是如此，但这对您的研究意味着什么？

        为了讨论这个问题，我们将Kronstadt 等人(2022) [1]发表的文献作为一个案例研究。通过他们的案例，深入探讨了他们的结果的细节，并讨论您的EV 分离纯化中可能存在污染的原因和存在方式。

        友情小提示：与其他技术相比，使用qEV Gen 2 尺寸排阻柱可以显著减少污染！

        您如何确定 EV分离物的生物活性是否取决于EV本身？

        为了解答这个问题，Kronstadt等人(2022) 使用了可靠的HEK293T 细胞。然后分别使用超速离心(UC)、切向流过滤(TFF) 、qEVoriginal 35 nm Series Gen 2尺寸排阻将EV分离纯化出来。首先他们发现，无论采用哪种技术，EV粒径大小在统计上都没有变化（图1）。

图1. 通过超速离心(UC)、切向流过滤(TFF) 和 qEV Gen 2尺寸排阻柱从培养瓶中培养的HEK293T 细胞中分离出的细胞外囊泡的大小。虚线代表mode粒径，而周围的实心区域代表误差。改编自 (Kronstadt et al. 2022) [1]。  

        这个研究接下来调查了抑制小鼠巨噬细胞中脂多糖(LPS) 诱导的炎症的能力。在这里，需要特别注意的是HEK293T细胞不会释放抗炎EV。

        为了进一步测试是否可以检测到错误的生物活性，作者研究了三种细胞因子/趋化因子的分泌，并进行了各种实验以了解任何抑制特性的来源。他们运用ELISA检测细胞因子/趋化因子的分泌。

活性EV成分或FBS污染物？

        当应用于巨噬细胞时，使用三种技术分别获得的EV分离物都导致了LPS引发IL-6 分泌的抑制现象。因此，似乎结论是IL-6 分泌的抑制因子可能是基于EV的。 但是，由于新鲜培养基与HEK293T 条件培养基同样能够抑制IL-6，所以此抑制因子也可能来自培养基而非HEK293T细胞（图2）。具体来说，它可能来自胎牛血清(FBS) (图2B)。

图2. LPS诱导的小鼠巨噬细胞的IL-6分泌。小鼠巨噬细胞暴露于LPS ，和分别使用超速离心（UC）、切向流过滤（TFF）或 qEV Gen 2  尺寸排阻柱进行EV分离的新鲜培养基（± 胎牛血清；FBS）或HEK293T 条件培养基（+ FBS）。蓝色阴影区域代表暴露于LPS 的最大分泌量和暴露于LPS 加上一种抑制剂的最小分泌量。统计结果由Tukey post hoc test的双向方差检测。** = p<0.01；**** = p<0.0001。改编自Kronstadt 等人(2022)[1].

        在研究 LPS 引起的RANTES 分泌（一种趋化因子）时，只有UC 分离纯化（以及在另外一些实验中，TFF）导致分泌的抑制。由于与qEV分离纯化相比，UC与更大程度的可溶蛋白质污染相关。因此这种情况下，对RANTES的抑制因子可能是可溶性蛋白质。与IL-6抑制一样，实验表明对RANTES的抑制因子似乎来自培养基中的FBS，而不是细胞本身（图3）。

图3. 暴露于 LPS 的小鼠巨噬细胞RANTES的分泌。小鼠巨噬细胞暴露于LPS ，和分别使用超速离心（UC）、切向流过滤（TFF）或 qEV Gen 2  尺寸排阻柱进行EV分离的新鲜培养基（± 胎牛血清；FBS）或HEK293T 条件培养基（+ FBS）。蓝色阴影区域代表暴露于LPS 的最大分泌量和暴露于LPS 加上一种抑制剂的最小分泌量。 统计结果由Tukey post hoc test的双向方差检测。** = p<0.01； **** = p<0.0001。 改编自Kronstadt 等人(2022)[1].

        最后，对于TNF-α，只有TFF（在另外一些实验中，UC）分离出TNF-α分泌的抑制因子。该抑制因子似乎存在于新鲜培养基中，并且在更大程度上存在于HEK293T 条件培养基中（图4）。

图4. 暴露于 LPS 的小鼠巨噬细胞的TNF-α分泌。小鼠巨噬细胞暴露于LPS ，和分别使用超速离心（UC）、切向流过滤（TFF）或 qEV Gen 2  尺寸排阻柱进行EV分离的新鲜培养基（± 胎牛血清；FBS）或HEK293T 条件培养基（+ FBS）。 蓝色阴影区域代表暴露于LPS 的最大分泌量和暴露于LPS 加一种抑制剂的最小分泌量。 统计结果由Tukey post hoc test的双向方差检测。 * = p<0.05；**** = p<0.0001。 改编自Kronstadt 等人(2022) [1].

总结

        总体而言，很明显，使用SEC (文中qEV Gen 2 柱)分离EV可提供纯净的EV分离物，与UC或TFF相比，它大大降低了非EV来源的污染。分离方法越纯粹，分离中出现非EV的可能性就越低。

        然而，作者还强调了使用FBS 时的一个重要考虑因素。FBS 应添加到培养基中，然后使用UC法去除EV。无论分离方法有多好，它都无法区分您希望样本中出现的EV和样本中不希望出现的其他来源的EV。

这对您的EV分离意味着什么？

        您可能刚刚更改了EV分离纯化流程（或者您可能正在考虑这样做）并且看到了与以前不同的结果。虽然这非常令人沮丧，但了解此更改的原因很重要。运用qEV Gen 2系列，我们能比以往提高EV分离纯化的纯度。正如您在图 5中所见，Gen 2系列具有明显更高的EV与蛋白质比率，该比率通常用于EV 领域作为纯度的衡量标准。凭借可提供如此的高纯度和快速且可反复的分离纯化方法，相信您已经有很多理由选择qEV Gen2尺寸排阻柱进行EV分离纯化。

图 5. 每微克蛋白质的细胞外囊泡(EV) 数量，分别通过可调谐电阻脉冲传感技术和二辛可宁酸测定法测量。 显示了使用Izon 的自动馏分收集器(AFC) 和 70 nm 和 35 nm 系列的 qEVoriginal Gen 2 尺寸排阻柱（0.5 mL 上样体积）分离的人血浆样品的数据（来源于Izon内部数据）。

        与第一代Legacy尺寸排阻柱或其他方法相比，我们的Gen 2提纯技术可能会改变您对EV的认识。更棒的是，这也可能会改变一些实验假设！当然，改变你的假设是乏味的，但最终它是一件好事。这意味着你现在比以前更正确。我们对科学中“真实”的看法总是随着方法的改进而改变。站在精度革命的最前沿，并通过今天的qEV Gen 2 尺寸排阻柱改进EV的分离纯化。Izon Gen 2尺寸排阻柱现已上市，适用于150 μL 至 100 mL的样品量，您甚至可以以折扣价批量购买！

        如果您需讨论 qEV Gen 2 尺寸排阻柱系列如何帮助您在EV分离纯化中获得更高的纯度，或查询批量折扣，请联系我们。

参考文献

1. Kronstadt,     S. M., Van Heyningen, L. H., Aranda, A. & Jay, S. M. Assessment of     anti-inflammatory bioactivity of extracellular vesicles is susceptible to     error via media component contamination. Cytotherapy (2023).     https://doi.org:10.1016/j.jcyt.2022.12.002

转载来源：Izon Science