尿液是一种易于获取且富含诊断信息的来源，这使其成为仅次于血液的临床应用最多的生物体液 [1]。对尿液成分的兴趣导致了Wiggins等人在1986年的一项研究中首次发现我们所说的细胞外囊泡(EVs)，这远早于文献详尽描述EVs [2]。这些纳米大小的脂质双层囊泡包含了来自EV起源细胞的各种不同的RNA、蛋白质和小分子。正是这种类似黑匣子的特性，以及它们保护潜在不稳定分子不被降解的能力，使得EV在寻找生物标志物方面极具吸引力。它们在生物体液中的广泛存在增加了其潜在的诊断效用。与所有生物体液一样，尿液的独特组成影响了EV分离纯化所需考虑的特殊因素，而EV分离纯化是开发基于尿液的EV生物标志物的关键方面。

尿液的复杂成分

        尿液是一种独特的复杂生物体液。除了来自供者的细胞(如尿路上皮细胞、血细胞)，尿液中还可能含有细菌甚至病毒等微生物。有趣的是，尿液的这一特性已被证明在SARS-CoV-2大流行期间运用，在这一期间，废水中常规检测到病毒，因此即使在低流行地区也可以绘制疫情分布图 [3,4]。事实上，SARS-CoV-2、流感和HIV等有包膜的病毒都被包裹在宿主细胞膜中，并且可能与EVs共享生物发生途径 [5]。这使得两者很难区分。一些病毒在大小和密度上与EVs相当相似，因此在病毒感染患者中分离EVs时可能不可避免地同时分离出病毒颗粒 [6]。因此，除非正在研究的病理现象是相关感染，否则在发现性研究中应考虑排除病毒或细菌感染的患者/参与者。

        通常，尿液中的蛋白质水平比血浆低约1000倍 [7]。然而，这种情况在疾病中会发生巨大变化。因此，根据你的研究领域，尿蛋白水平可能会有很大差异。即使在健康个体中，尿液的浓度和成分也会因许多因素而异，包括性别、年龄、水合状态、饮食和收集时间。国际细胞外囊泡学会(International Society of Extracellular Vesicles)尿液工作组(Urine Task Force for the International Society of Extracellular Vesicles)的意见书建议使用检测常见尿液参数(如pH、血液污染)的试纸，以快速确定样本是否适合分析 [1]。关于尿液浓度的标准化(例如肌酐浓度)的其他建议也可参考该意见书 [1]。尿液成分对储存、预处理和EV分离有多种影响，这意味着在使用这种生物液进行EV研究时需要特别考虑。

EVs研究中收集尿液的考虑因素

        分离尿液EVs首先要考虑的是收集过程本身。尿液收集过程引起的变异主要有两个来源：收集时间和无效量。一般认为，从一天的第一次排尿收集尿液时，尿液最浓(可能含有更多的EV)。然而，这对EV特性的影响程度仍存在争议 [10,11]。还可以进行24小时尿液收集(例如，将24小时期间所有尿液的样本合并)，以最大限度地增加样本量，并将全天的差异最小化。第二个需要考虑的是什么时候在尿液中取样本(例如，从初段或中段尿收集)。由于尚未就EV研究中尿液收集的最佳实践达成共识，因此在每项研究中保持一致是很重要的。这一原则的例外是从尿液中分离前列腺EVs，目前已知直肠指检会在检查后立即收集的尿液中会产生更多的前列腺EVs [12]。

EVs研究的尿液预处理：方法考虑

        与所有生物体液一样，尿液的预处理是必不可少的。对于不同的生物流体，这种预处理看起来不同，但常见的第一步是使用离心法移除细胞。对于尿液来说，这也可能包括细菌颗粒。然而，还有另一个需要考虑的因素——尿调节素。尿调节素(也称为Tamm-Horsfall蛋白)是一种含量丰富的尿糖蛋白，可聚合成丝，并将EVs包裹在丝内 [13]。这些聚合物在尿液处理前通常保持的低温(即4℃左右)下特别容易形成。然而这种冷藏方法对尿液尤其重要，因为尿液样本通常由患者自己收集，因此不能立即处理。根据美国国立癌症研究所(NIH National cancer Institute)基因组数据共性(Genomic data commons) [14] 的数据，尿调节素在某些肾癌病例中呈高表达，可能延长生存期，这提示在肾癌患者样本中更强调去除尿调节素的重要。

        已有研究表明，在2000 x g离心30分钟可使大部分尿调节素颗粒化而不显著损失EV [15]。当将质谱法用于EV蛋白分析时，这种方法可能有用，在这种情况下，非EV蛋白的移除特别重要。另一种已报道的方法旨在利用还原条件解离尿调蛋白聚合物，但这可能是导致蛋白质构象的变化，从而影响Western blot EVs蛋白标记物的检测 [15]。在Musante et al. (2014) 的研究中，可调谐电阻脉冲传感技术(TRPS)被用于测量EVs的浓度和粒径，因此，当目标是确定准确的EVs粒径和浓度时，使用还原条件进行尿调蛋白解离可能比离心法更合适，因为它可以避免EVs丢失的风险。

储存EVs分离前处理过的尿液样本

        经过预处理后，尿液通常必须储存，之后才进行EV分离，有时在生物样本库中需要长时间储存。文献中建议在-80℃下储存 [10]。然而，根据TRPS的测量结果，无论EVs是在-20℃、-80℃和-196℃保存，在1年的存储期间，EVs浓度均下降，EVs粒径均上升 [16]。该研究发现，纳米颗粒跟踪分析无法确定除-20℃以外的任何温度下EVs粒径的增加，这突显出TRPS在这一背景下是一种更敏感的技术 [16]。

从处理过的尿液样本中分离EVs

        接下来是EVs的分离，尿液样本最常用的方法是超速离心法，但该技术在该领域有很大的变异性和非标准化 [1]，导致不同研究之间可能分离出不同的EVs亚群。尿液还含有相当数量的白蛋白，这意味着将EVs与处理后尿液中的可溶性蛋白良好分离对于防止分离的馏分污染至关重要。最近，研究开始比较从尿液中分离EVs的方法，以最大限度地提高纯度和可重复性。

        一项研究发现，与基于沉淀的方法相比，使用qEV的尺寸排除色谱法(SEC)获得了较高的EVs纯度(即较低的蛋白质污染) [17]。有趣的是，另一项研究发现，超速离心法从尿液中分离EVs的效果欠佳，是比较的5种技术中浓度最低的 [18]。使用qEVoriginal/70 nm色谱柱在同一研究中分离出了高浓度的EVs，并显示出最高的颗粒蛋白比率(表明高纯度)。沉淀和超速离心均导致纯度较低。在本研究中，qEV EVs分离馏分也不含尿调节素，而超速离心法显示出高水平的尿调节素污染 [18]。最后，在来自qEV柱的分离馏分中，EVs的四跨膜蛋白标志物水平最高 [18]。另一项研究与这些发现一致，表明当与使用超滤的预浓缩相结合时，qEVsingle/70 nm柱在尿液EVs分离方面表现优异，尤其是在RNA研究方面 [19]。此外，另一项研究也一致认为SEC更优。因此，大量文献提示qEV是一种优于其他方法的尿液EVs分离方法。这对于EVs生物标志物研究尤其重要，因为EVs生物标志物的纯度至关重要。

尿源性EVs：生物标志物的金矿?

        尿液易于收集，甚至可以由患者自己收集，这使尿液成为EVs生物标志物的潜在理想来源。因此，大多数对尿液EVs的研究都集中在它们的生物标志物应用上。下面是一项尿液EVs研究的成功案例。

        PCA3和融合基因TMPRSS2:ERG的mRNA转录本在21世纪初首次被确定为前列腺癌的预测因子，并在2009年被确定存在于前列腺癌患者的尿液EVs中 [21]。此后，这两种mRNA的组合已在许多大型研究中得到验证，现在成为了FDA的突破性设备指定诊断试验，具有预测疾病进展和指导活检需求的能力。其他生物标志物研究的重点是糖尿病肾病 [25,26]、乳腺癌 [27]、胆管癌 [28]、胰腺导管腺癌 [29]、狼疮相关肾炎 [30-32] 和其他许多病理。因此，对尿液EV生物标志物的研究逐年增加也就不足为奇了，如图1所示。然而，改进尿液收集、预处理和EVs分离的标准化和方法在这研究过程中非常重要。

图1. 标题中提到了“尿液”和“细胞外囊泡”或“外泌体”，在标题或摘要中提到了“生物标志物”的文章数量。数据搜索来源于Web of Science。

尿液EVs研究的关键问题

        尿液EVs研究在数量上已经相当多了，但仍有一些关键问题未得到解答。

        1. 哪种方法去除尿调节素最好?去除尿调蛋白是提高EVs产量和纯度并防止可能的亚群丢失的关键。离心和还原条件都显示出希望，但在样品中保存功能性EVs的最佳条件尚未确定。

        2. ‍尿液EVs研究的最佳标准化方法是什么?尿液浓度和含量因患者因素而有很大差异。经过测试并达成一致的一组标准化因子将有利于提升重现性。

        3. ‍该领域会减少超速离心法的使用，转向更好的技术吗?在尿液EVs领域的比较研究表明，使用SEC分离优于使用超速离心法分离。鉴于超速离心方案缺乏一致性，因此使用qEV分离系统转为标准化的工作流程可能会改善生物标志物研究之间的一致性。

        迄今为止，从尿液中识别生物标志物尤其成功，但在临床中仍缺乏基于尿液EVs的诊断方法。提高尿液收集的标准化，再加上改进和简化的EVs分离流程，可能有助于这些生物标志物研究从实验室走向临床。