简介：无论是在辅助生殖学，病毒学或其他学科上，内生殖道是细胞外囊泡的潜在宝库。在本文中，我们将讨论内生殖道中细胞外囊泡的分离纯化和应用。

        监测和了解来自生殖道的生物液体的组成，不仅对促进人类生殖健康，而且对保护性农业的应用至关重要。例如，生物标志物可用于微调人类和动物辅助生殖技术(ART)的窗口期，从而提高ART的成功率。在鉴定有益于卵母细胞、胚胎或精子的生物液成分方面也是一样的，特别是如果这些成分是ART技术合适的辅助用剂。此外，这些生物液体可能是疾病诊断和了解生殖道疾病发病机制的关键。

        生物液体中最通用和最复杂的组成部分之一是细胞外囊泡 (EV)。EV是纳米级的脂双层囊泡，包含各种蛋白质、核酸和来自其起源细胞的小分子。这使得它们成为具有吸引力的生物标志物候选物，并成为起源细胞和目标细胞之间细胞间通信的有效介质。本文将重点讨论来源于卵泡液、输卵管液、子宫液和阴道液的细胞外囊泡的分离纯化和相关研究。

生殖道液体的组成

        如果你的目标是分离EV，了解生殖道液体和血浆之间的一般区别是有用的。不幸的是，这里讨论的大多数生物液都没有详细记录的生化组成，因此在这里我们对这些生物液体进行很有限的总蛋白、葡萄糖和钠含量比较(表1)。

        总蛋白作为EV分离的最关键潜在污染物，是需要考虑的重要成分。虽然输卵管、子宫和阴道液体的蛋白质浓度都约为血浆总蛋白质浓度的一半，但在这些生物液体中，EV浓度和EV与蛋白质的比例尚未完全确定。

表1. 人类生殖道液体的成分比较。数值表示与血浆相比，每种生物液体的近似倍数变化。改编自[1-8]。

从生殖道液体中分离EV的注意事项

        迄今为止，尚未对生殖道液体的EV分离方法进行广泛研究；因此，目前没有足够的数据来推荐阴道液体的EV分离方法。然而，2021年的一项研究比较了子宫液体[9]的EV分离方法，并确定使用qEV尺寸排阻柱(qEVoriginal)(SEC是所考虑的选项中表现最好的，qEV纯化柱的分离物提供干净的电镜照片，蛋白质污染低，EV标记物CD9，TSG101和flotilin-1 富集良好 [9]。另一项卵泡和输卵管液EV的研究比较了qEV纯化柱和密度梯度超离心(DG-UC)，发现尽管EV大小和浓度没有差异，但DG-UC分离EV培养的囊胚质量优于qEV分离EV培养的囊胚 [10]。然而，这项研究并没有确定EV或一同分离下来的蛋白质是否导致了这种差异。这一点尤其重要，因为尺寸排除色谱法可以分离功能活跃状态的EV，这使得囊胚质量的差异不太可能是由于EV功能的差异，而更可能是由分离出的EV的特定亚群或者DG-UC分离中非EV结构的污染物造成了这种差异 [11]。MISEV指南建议对不含EV馏分进行功能测试，以确保在EV富集馏分中看到的任何影响都是由于EV，而不是其他组成成分造成的 [12]。为了真正衡量最有效的EV分离方法，建议使用EV大小、纯度(即低蛋白质污染)和形态作为分离成功的衡量标准。

生殖道EV的功能生物学和生物标志物潜能

        卵泡液是卵泡中含有的液体，卵母细胞在卵泡中成熟。在卵泡发育过程中，从含有未成熟卵母细胞的小卵泡到含有成熟卵母细胞的大卵泡(见图1)，从卵泡液中分离出的EV的含量发生变化 [13-15]。这与小卵泡分泌的EV促进颗粒细胞(围绕着卵母细胞产生激素的细胞)增殖的能力增强有关，可能反映了它们在卵泡发育中的作用 [14]。

图1. 生殖道示意图，标记处为目前研究感兴趣的分离EV的位置。

        从医学和农业的角度来看，卵泡细胞的EV可用于ART治疗，因为从卵泡液中分离出的卵泡EV可促进冷冻保存后解冻的卵母细胞减数分裂能力的恢复 [16]。这在保存卵母细胞方面也可能特别重要，因为卵母细胞可能必须被低温保存很长一段时间，直到找到适合受精的精子。

        输卵管液是输卵管内的液体，卵母细胞通过输卵管与精子相遇，受精和早期胚胎发育也在输卵管内发生。在整个发情周期中，EV的含量会发生变化——例如已经报道的EV内部的RNA、蛋白质和小分子 [17-18]。这一变化的部分原因是EV能量底物和参与能量生产的酶的增加，这些酶可被输送到胚胎中以帮助其生长 [17]。对于ART治疗，包括用于农业、保育和人类生育的ART治疗，输卵管液EV可能特别重要。输卵管液EV可以改善体外胚胎质量和发育[19-22]，甚至可以提高小鼠的出生率 [20]。对于精子，通过输卵管到达卵母细胞，输卵管EV已被证明可以提高精子获能(例如，受精所需的精子成熟阶段)，活力和流动性 [23-26]。这表明，在需要模拟生理条件的ART治疗中，输卵管液EV可能特别有用。

        对子宫液EV的兴趣主要集中在胚胎成熟到着床的过程中。这一阶段涉及到胚胎和子宫内膜(即子宫内膜)之间的双向交流。从子宫液中分离出的EV可能参与妊娠的识别，在妊娠15-17天的子宫液EV中存在胚胎来源的CAPG(妊娠信号识别 [27])。在体外，子宫EV已被证明能增加囊胚的形成和孵化(即着床的必要步骤) [29]。相反，子宫内膜炎奶牛的子宫液EV抑制囊胚发育 [30]。其他研究表明，子宫液EV可能有助于胚胎着床，可能通过涉及干扰素tau的机制 [31-34]。综上所述，这些研究表明子宫液体EV对于胚胎发育和着床后期的双向通信很重要，提示可能在ART治疗中使用。

        阴道液体EV可在阴道冲洗后从液体和粘液组分中的一种或两种中回收。有趣的是，这些EV可能有助于寻找子宫内膜异位症的诊断试验，这种疾病平均需要7年才能诊断出来 [35]。一项对自发出现子宫内膜异位症的猕猴的早期研究发现，阴道液中的EV浓度显著降低 [36]。虽然这还不足以用于诊断性测试，但它确实为子宫内膜异位症中阴道EV的改变的研究带来了希望，从而提供了一种可获得的诊断性测试。

        阴道EV也可用于宫颈癌诊断，因为发现宫颈癌患者阴道液EV中miR-21和miR-146a这两种miRNA增加 [37]。在病毒感染中也可看到阴道液体EV的变化，特别是EV miRNA在宫颈癌的致病感染、人乳头瘤病毒(HPV)和主要影响非人灵长类动物的艾滋病毒(HIV)的近亲，猴免疫缺陷病毒(SIV)，的感染中发生改变 [38,39]。在SIV及其人类同类HIV中，阴道EV也被发现具有抗病毒作用，减少病毒复制 [39,40]。这可能会对性获得性艾滋病病毒感染的预防性治疗的发展产生影响，需要进一步的研究。

生殖道液体EV研究的关键问题

        为了促进生殖道液体中EV相关研究的发展，仍有几个关键问题有待解决：

1. 生殖道液的生化成分是什么?

        对这些液体的分析研究仍远远低于大多数生物液体。这一信息将有助于优化生殖道液体中EV分离纯化，特别是在诊断或治疗方面。这对于阴道液体尤其重要，因为阴道液体的黏度可能会影响EV的恢复率。

2. 生殖道EV如何在解剖位置之间进行比较?

‍        例如，子宫EV的潜在诊断变化是否可反映在阴道EV中？如果是这样的话，这可以减少诊断测试的侵入性。

3.基于EV的子宫容受性和妊娠识别测试在农业上应用可行吗?

‍        为了对子宫容受性和妊娠识别进行快速诊断，很可能需要在同一位置进行很多检测。这将需要用户使用便利的、标准化的商用EV分离纯化和下游诊断测试，以尽量减少产生的错误。像qEV这样的EV分离系统，包括优化的纯化柱与自动馏分收集器(AFC)的自动化配合，将是这种应用的理想选择。

4. EV是否可以进行除血液检测外的生殖道疾病检测?

        来自生殖道液体的EV已显示出作为疾病生物标志物的潜在来源的前景，但目前尚不清楚这些EV是否能优于针对相同疾病的循环中的潜在生物标志物。

        这一领域的研究表明，生殖道液体EV在从医学到农业和环境保护等各个领域可能具有多么大的价值。这使得该领域的研究不仅可能对人类健康产生革命性影响，而且对全球农业也具有潜在的极高价值。

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转载来源：Izon Science

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