简介

​        尿液是一种重要的生物液体，含有多种细胞外囊泡(EV)，包括外泌体、微泡和凋亡小体。尿液EV是良好的发现生物标志物的非侵入性的尿蛋白质组和转录组来源 [1]．尺寸排除色谱法(SEC)是一种广泛应用的分离纯化技术，用于分离来自各种生物流体中不同大小分子的复杂混合物 [2,3]。Izon的qEV色谱柱是一种可从尿液中分离EV的强大的标准化技术，于2021年陆续推出的Gen 2二代qEV拥有更优秀的效率。这些可以用来在早期揭示泌尿系统疾病或肿瘤的进展。Izon Science的自动馏分收集器(AFC)自动化qEV分离纯化过程，消除人为误差并启用高精度、精简的工作流程。

一般建议

        所有qEV色谱柱都有两个分离范围选择，qEV/35nm系列以及qEV/70nm系列。最佳回收率的颗粒在35至350nm之间，推荐使用qEV/35nm系列色谱柱。最佳回收率的颗粒在70至1000nm之间，建议使用qEV/70nm系列色谱柱。

qEV使用前的样品预浓缩 

• 尿液需要适当浓缩，以便能达到EV浓度检测的下限。浓缩设备的大小和型号取决于样品体积。离心浓缩器适用于较小的样品 (例如，Amicon Ultra和Centricon Plus-70离心过滤装置)。切向流装置 (例如，Pellicon®(默克Millipore)或Minimate™(Pall Laboratory)))用于较大体积。

• 据报道，100 kDa膜的外泌体纯度略高 10KDa。

• 由于达到了更高的流速，压力驱动的切向流浓缩更适用于容量超过400毫升的情况。外泌体丢失仅在前50-100毫升样品中可见。

样品处理

• Tamr-Horsfall Protein (THP)又称尿调素，是正常人体的尿液内含量最多的蛋白质。该单体蛋白约为85 kDa，但在尿液中可大量存在总计可达几百万道尔顿的聚集体。当尿液浓缩，特别是在较低的pH值，THP形成一种凝胶，在低速离心过程中可吸附尿外泌体 [4]。

• 通过将尿液样本在二硫苏糖醇(DTT) 200 mg/mL中37°C孵育10分钟后于17000 x g离心10分钟，可去除THP。

上样qEV色谱柱 

• 上样高于推荐上样量的样品可能会导致后续EV馏分的纯度下降，这是由于蛋白峰和EV洗脱峰之间在这种情况下有更大的重叠，使得在EV馏分中杂蛋白含量增加。例如，Gen 2 qEVoriginal的最佳样品量是0.5 mL， 可收集到1.6毫升的EV馏分。

图1.使用qEV从尿液中分离EV的示意图

表1. qEV型号和推荐收集体积。

方法

1.准备新鲜的1X PBS溶液，然后使用0.22 μm过滤器过滤。

2. 用室温的PBS溶液平衡qEV色谱柱。

a.缓冲液脱气处理，平衡缓冲液和qEV到室温，将有助于避免在凝胶中形成气泡，使凝胶开裂。

3.收集尿样，在4°C下180×g离心10分钟，然后在4°C下1,550×g离心20分钟。在离心步骤之间将上清转移到另一个管中，注意不要破坏沉淀。

4. 将无细胞和碎片的尿液样本浓缩到建议的qEV上样量(见表1)。

5. Izon推荐使用例如Amicon®超离心过滤器(0.5 -15)和Centricon Plus-70离心装置(容积可达400毫升)。对于较大的容积，使用切向流过滤系统，例如Pellicon®(默克Millipore)和Minimate™(Pall Laboratory)。

6. 如果浓缩样品粘稠，在上样qEV前，请使用推荐的DTT孵育法去除Tami-Horsfall蛋白。

7. 将合适型号的qEV固定在AFC上或qEV支架上，并上样相应体积的样品。备注：使用Izon自动馏分收集器可自动化收集，消除人工收集的误差。如果手动收集，参考下面视频。

a. 确保样品的体积适合所使用的qEV型号；请访问www.izon.com获取更多的信息。

8. 开始收集空隙体积和EV馏分。

a.不同样品的洗脱曲线和纯度可能略有不同，因此推荐首次纯化样品时，对EV浓度和蛋白质污染物的含量进行测量。

9. 在完成EV馏分的收集后，按照qEV说明书进行清洁和再生，然后继续下一个样品或者保存qEV。

10. 尿液细胞外囊泡已准备好用于下游应用。Izon建议使用TRPS分析用于EV的标准化表征和量化(尺寸、浓度和电荷)。

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