简介：滑液是一种高粘性的生物液体，含有免疫细胞衍生的细胞外囊泡，这可能是关节炎的关键，但你应该如何分离它们么? 关于它们我们已经知道了什么?

        滑液是滑膜关节囊内作为减少摩擦的液体。滑膜关节是人体最常见的关节类型，例如髋关节、膝关节和肘关节。这些关节易患关节炎，如风湿性关节炎和骨关节炎。由于滑液是在这些情况下组织受损/炎症周围的生物液，其在受影响关节中的组成可能是了解发病机制和疾病的关键。在寻找答案的过程中，滑液衍生的细胞外囊泡(SF-EVs)引起了研究人员的兴趣。EV是纳米大小的囊泡，其中蛋白质、核酸和来自细胞起源的小分子被包裹在脂质双分子层中。这些货物可以被运送到目标细胞，在那里它可以有各种各样的影响。这些特征使EV作为生物标志物具有吸引力，但也使它们对理解疾病的发病机制(如滑膜关节疾病)至关重要。在这篇文章中，我们将讨论滑液的组成及其对分离EV的影响，然后突出SF-EV的关键研究。

滑液的成分 

        滑液中的主要细胞类型是免疫细胞，被认为是SF-EV的主要来源 [1]。与大多数炎症情况一样，滑液关节的炎症与白细胞的大量浸润有关，这使得免疫源性EV成为SF-EV研究的主要重点 [2]。为了能够有效、纯粹地分离EV，必须对滑液的非EV成分有一个基本的了解。 

        与脑脊液一样，滑液是血浆的超滤液，约有三分之一的血浆总蛋白浓度 [3]。虽然蛋白质含量相对较低，但SF-EV浓度是未知的。这意味着EV与蛋白质的比例目前无法与血浆进行比较——大多数血浆EV分离方法都得到了优化。已知与血浆不同的是滑液的粘度，其粘度与生的蛋白类似。与其他体液相比，粘度是滑液最大的区别，因为关节内的润滑特性需要这种粘度。这种粘度主要来自粘弹性透明质酸的存在，它是一种高分子量的糖胺聚糖聚合物 [4]。透明质酸与蛋白多糖润滑素一起，由滑膜上的成纤维细胞样细胞分泌，这些细胞排列在关节囊的向内一侧 [5]。透明质酸和润滑素都有助于滑膜液的非牛顿粘度，这表明滑膜液在纯力作用下变薄 [6]。黏度在疾病中也会改变 [7]。这对受黏度作用的EV分离方法(如超离心)具有一定的影响。

从滑液中分离EV的注意事项

        如前所述，从滑液中分离EV的最大考虑因素之一是透明质酸，这导致许多研究在流程中添加了透明质酸酶。然而，唯一报道透明质酸酶的影响是增加了10000 x g下的沉淀颗粒和减少了100000 x g下的沉淀颗粒，同时显示了CD44阳性EV增加 [8]。SF-EV可以附着上透明质酸 [9]。目前只有一项关于该问题的研究发表，透明质酸酶对EV分离的回复率的影响尚未达成共识。然而，有更多的证据表明SF-EV分离方法对纯化的EV质量的影响。

        Foers等人(2018)试图比较传统超速离心法UC，密度梯度法 (DG-UC)与尺寸排除色谱法(SEC)从滑液中分离EV的效果[10]。UC和DG-UC方法都存在大量的高密度脂蛋白污染物，并在透射电子显微镜照片中观测到普遍的非晶态物质。然而使用SEC法，高密度脂蛋白标记物与EV标记物良好地分离开，电镜照片更干净，这意味着SEC被推荐为最好的技术 [10]。不幸的是，在这项研究中使用的SEC运行时间非常长(150分钟)，这使得它不适合高通量研究，甚至不适合低通量研究 [10]。使用qEV尺寸排阻纯化柱只需15分钟，研究可以规模化。Chen等人(2022)的一项研究证实了qEV柱的速度，该研究比较了UC、沉淀法和qEV SEC [11]。qEV纯化柱是文中最快、最纯净的分离方法，去除了大部分蛋白质污染 [11]。与Foers等人(2018)运行时间久的SEC不同，Chen等人(2022)使用的qEV SEC纯化柱在EV馏分中没有显示纤维蛋白网污染物。因此，不仅文献表明SEC是相对优秀的方法，而且推荐qEV纯化柱 [10,11]。

关节炎的比较：滑液细胞外囊泡的研究

        虽然存在多种关节炎，但最常见的是骨关节炎和类风湿性关节炎。类风湿性关节炎被描述为炎症性关节炎，虽然炎症确实在类风湿性关节炎的发病机制中起着更大的作用，但这在一定程度上不准确地低估了炎症在骨关节炎病情持续发展中的作用。大量关于SF-EV的研究将两者进行了比较，但由于从健康患者收集滑膜液受到伦理限制，这些研究常常将骨关节炎作为对照。因此，这些研究中可能遗漏了EV在其中一种关节炎或这两种关节炎下的变化。尽管只把类风湿关节炎和骨关节炎比较的方案存在缺陷，但多项研究发现，与骨关节炎相比，类风湿关节炎中EV的数量明显更高 [12-14]。这表明SF-EV在类风湿性关节炎中可能非常重要。

        大多数SF-EV研究主要集中在研究EV的起源，主要集中在免疫细胞标记物上。这些研究表明，类风湿性关节炎中的EV富集来源于成纤维细胞[13]、T调节细胞[12]、CD4+ T辅助性细胞[15]、CD8+细胞毒性T细胞[1,15]、单核细胞[15,16]、血小板[17]，以及一般的粒细胞[15]和特定的中性粒细胞[12,13,16]。相反，骨关节炎的EVs富集来源于活化的T细胞[18]、巨噬细胞[18]、B细胞[18]和自然杀伤细胞[18]。但是这些免疫衍生的EV有什么作用呢?

        类风湿关节炎患者SF-EV中的蛋白分析显示富集于补体和凝血级联蛋白以及那些参与趋化作用的蛋白 [14]。一项研究发现，来自类风湿性关节炎患者的SF-EV可导致滑膜的成纤维细胞样细胞产生更多的细胞因子和其他在骨关节炎和类风湿性关节炎中已知作用的蛋白质 [20-22]。当比较两项研究中SF-EV蛋白在类风湿关节炎和骨关节炎中的变化 [13,14] (图1)时，两个研究的数据集中出现的最高变化的类风湿关节炎EV蛋白是类风湿关节炎生物标志物S100A9 [23,24]。另一种在类风湿关节炎SF-EVs中上调的蛋白是Vimentin(图1)。Vimentin的瓜氨酸化形式存在于SF-EVs [25] 中，是类风湿关节炎患者的一个重要自身抗原 [26，27]。这个列表上的其他蛋白质(图1)也被证明与类风湿性关节炎或发生改变有关。因此，类风湿关节炎中的SF-EV有可能使炎症延续。

图1. 类风湿性关节炎和骨关节炎患者滑膜液中EVs蛋白水平的比较。数据来自蛋白质组学研究的数据 [13,14]，显示为log2倍的差异。

        此外，类风湿关节炎患者中的这些SF-EV也含有靶向细胞因子途径的miRNAs，且抗炎妊娠区蛋白高度丰富，提示其参与调节炎症 [14,28]。这种促炎和抗炎性质可能在同一个EV中共存，也可以在来自不同细胞来源EV的不同亚群中分离。已有研究表明，来自骨关节炎患者的中型SF-EV代表了大多数B细胞来源的EV，然而大型和小型EV富集于巨噬细胞来源的EV [18]。该领域的研究目前使用大量不同的EV分离纯化技术，这可能导致通过分离不同亚群的研究之间缺乏某些一致性，这可以通过采用一种对滑膜液EV分离中表现良好的标准化方法来改善，比如qEV纯化柱。

滑液EV研究的关键问题

        为了使该领域朝着产生临床效益的方向发展，必须回答几个关键问题。

        1. EV是否显示由这些免疫细胞产生的免疫细胞标记?当一个EV对免疫细胞标记物呈阳性时，假设该免疫细胞是该EV的起源。然而，目前还不确定这是否正确，也不确定这些EV是否来源于关节疾病病理中异常表达这些蛋白的其他细胞。

        2. 由于缺乏健康对照，我们是否错过了潜在的重要生物标志物或治疗候选?由于伦理限制，几乎所有的SF-EV研究都将骨关节炎作为对照样本。然而，免疫失调明显存在于骨关节炎关节。

        3.SF-EV分离方法的标准化能否提高研究之间的一致性? 目前，在不同的研究中，使用用于EV分离的来源细胞之间存在很大的不一致，这表明需要更大的研究组群、标准化的方法和系统的综述。

        关于SF-EV的研究已经指出了其潜在的炎症(和/或抗炎)作用，但SF-EV对其周围组织的影响还有待充分确定。这些微小的囊泡可能是炎症性关节疾病新的治疗靶点的关键吗?

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转载来源：Izon Science

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